Presentation av artikeln "Identifiering av Yersinia
enterocolitica gener som påverkar överlevnad hos ett djur
värd med hjälp av signaturer taggade transposon mutagenicitet. "
Andrew J. Darwin & Virginia L. Miller, 1999.
Inledning
Jag ska här granska de viktigaste punkterna från
Ovanstående artikel från välrenommerade
tidskriften Molecular Microbiology.
Först ger jag bakgrunden till
undersökningen genomfördes, vad författarna
syfte och hypotes var hur de gjorde vad
de fick reda på och till slut kommer jag att kommentera
konsekvenser av resultaten.
Bakgrund
Tre arter av släktet Yersinia, en Gram-negativa
stavformigt fakultativt anaeroba Enterobacteriaceae,
patogena för människor. Dessa tre arter är Y.
pestis, Y. pseudotuberculosis och Y. enterocolitica
och är förknippade med både lokala och systemiska
infektioner. Det är den sista av dessa bakterier
författarna här behandlar, men
Resultaten är ändå viktiga för alla tre arter. Mån
tidigare identifierat ett 70KB virulensplasmid
med Yersinia, kallad pYV som finns i alla tre
arter. Gener på denna plasmid-nummer för många
virulensfaktorer som typ III sekretion
(TTSS) (diskuteras senare) och effektorproteinerne
till sekretion. Det är dock visat att pYV är inte ensam
på virulens, men det finns också kromosomala
gener inblandade. Blanda det andra gener
kodar för vidhäftning och penetration i värdcellen,
bindning av järn (siderophorersyntese) och
syntes av lipopolysakkarid O-antigen.
Syfte och hypotes
Som sekvensering av hela genom är
lättare, det var kartläggs genetiskt flera
patogena bakterier. Men brister fortfarande
mycket insikt i vilka gener som kodar för
proteiner, och i synnerhet vad gener är
involverade i bakteriell virulensmønster.
Grund av svårigheter med behovet av att testa varje
enda mutanter virulensegenskaber och tillhörande
gener i en testdyr hade vid denna
datum inte tidigare varit möjligt att göra
Storskaliga försök som skulle identifiera detta
för hela genomet. Vi kan nu genom
signaturer taggade mutagenes (STM). Här
Författarna gör en mängd olika mutanter, och en del
Dessa kommer att med nedsatt virulensegenskaber,
samtidigt testa flera stammar i ett
enda värd och sedan ta reda på vilka gener
i visst fall är störd.
De förväntar sig från studiens början till en serie
deras mutanter kommer att muterat i pYV och att dessa
skulle ha minskat drastiskt virulens. Dessutom har
de hoppas att upptäcka gener på en kromosom som
antingen inte vet eller inte är kända i
virulens och överlevnad i värden.
Metod
Ett antal signaturer taggade mutanter var
Tillverkas av PUT vektor som innehåller
mini-Tn5 km2 transposoner infördes i E. coli
stam CC118, och överförs sedan till Y.
enterocolitica stam JB580v via konjugering.
Dessa mutationer har granskats för införandet av den
sade transposon av ampicilin Urval
(Olika kolonisering mönster med och utan
in) och utfördes endast vid 18 Södra
stickprov som visades för
kanamycinresistens som satt på transposoner.
Preliminära studier visade att de mest
infektion metod på försöksdjur (6-7 veckor gamla
BALB / möss c) var intraperitoneal (IP) injektion
(Direkt injektion i buken), med ca. 107 colonyforming
enheter (CFU), följt av fångar från
mjälte efter 48 timmar.
För att undvika att injicera försvagas auxotrofe
bakterier valdes ut transposonmutanter
odlas på minimalmedium.
STM
Metod för att upptäcka försvagade bakterier
överlämnades gjort med InDesign turer-taggade
Mutagenes (STM). STM är en negativ
urvalsmetod där detta experiment använder sig
sin reserv av mutanter (21 pooler med 96 mutanter)
att infektera grupper av tre möss. Vad är speciellt med
STM är att in-DNA har en speciell
underskrift varumärke, en signatur tagg som är en liten
känner sekvens som senare kan hittas genom
Södra blot hybridicering. Under den inledande
screening infekterade möss och bakterier återvinnas
från mjälten. Dessa blandas och överförs till 96
kammare micro fnitter plattan. Då screener mån
med rätt original bakterier (ingång - alla
original mutanter) och de som fanns i mjälten
(Utgång - de överlevande). Så att du kan
hitta den försvagade bakterier av sin brist
närvaro i det samlade mjälten
bakterier (negativ selektion), vilket ses som
saknas eller är svag hybridicering jämfört med
från ingången (den första delen av Fig. 1 från artikeln). Sedan
fördes till mutanter som har visat bristande
hybridicering - försvagade så virulens, och körde
sekundär screening med samma förfarande som
innan men med två villkor (2x3 möss).
Detta bör bidra till att minska risken att
mutanter som faktiskt inte var försvagat (andra delen
fig. En från artikeln).
Därefter dämpas mutanter studerade
och klassificeras fenotypiska och genom kloning
följt av sekvensering och utfördes
konkurrens och vækstassays.
Resultat
Baserat på de två inledande STM screening
de hittade upp till 68 mutanter med försvagat
virulens. Som väntat, en del av dessa är
muterat i pYV och det konstaterades att 29
var pYV mutanter. Detta undersöktes genom
tillväxtmönster på LBMOX skyltar och kanamycinsensitivitet.
Detta innebär att av de ursprungliga 68
mutanter var 39 som hade mutationer i
kromosomala virulensgener. Av dessa var i
16 fall konstaterats samma fenotyp
(Aggregering i flytande medium, och grumlig tillväxt
LB agar plattor) på grund av en defekt i LPS
syntes och därmed syntes av O-antigen, som
är avgörande för Y. enterocolitica virulens. Så
det nu fanns 23 mutanter tillbaka där mutationen
Lör någon annanstans än i pYV eller LPS syntes
gener. Bekräftat om de verkligen
försvagat var det kontrolleras vart 68 i en tävling
test på möss, som mätt om bakterier
klarade sig sämre än vildtyp Y.
Enterocolitica. För denna provning fann man att 10 av
den 23 faktiskt försvagad och totalt sett var 55 av
68 faktum nedsatt. Detta i deras ögon, bra resultat
attribut det dubbla STM screenings
förfarande.
Genom pYV mutanter var särskilt typ III
sekretionsgenerne att ange var att identifiera och
särskilt i lcrV och yscL kan detta indikera ett
"Hot spot" för införandet av transposoner mini-Tn5
Km2 bara här (Fig. 2 från artikeln).
Av de 16 med misstänkt mutation i LPS / Oantigen
syntes apparater var detta kontrollerades
av sekvensering (Bild 2 från artikeln).
De återstående 10 kromosomala mutationer också
genom kloning och sekvensering studerats. Här var
Mån in, och därmed störningar i generna
kodade yttre membran syntes (yifH och nlpD)
näringsupptag / förvärv (pstC och irp1) och stress
svar (dnaJ). De sista fem hade mutationer i
gener homolog med E. coli gener som kodar för DNA
topoisomeras I (topas), phage chock protein
operon (pspC) och två hittades med
mutationer i yibP, en gen med okänd funktion i E.
coli. Äntligen hittat en mutation i en sekvens
Det var ofullständig i Genbank databas.
(Bild 2 från artikeln).
OBS. Artikeln gör återuppbyggnaden av pspC
mutant för vidare studier. Detta, jag
Förklara i fråga 3 senare.
Diskussion
De var i denna studie visade att STM teknik kan
användas för att identifiera ett antal gener i Y.
enterocolitica med mer eller mindre viktiga
för sin virulens. De var reidentificeret en serie
Viktiga virulensgener i pYV (typ III
utsöndra) och LPS syntes gener i
kromosom. Resultaten från den kromosom
mutanter påminde tidigare STM resultat
den sjukdomsalstrande gramnegativa bakterier Salmonella
typhimurium och Vibrio kolera som även
fann att bakterier med mutationer i gener
som deltar i O-anti-återförening teori, stress och
näringsupptag / förvärvet hade försvagat
virulens. Det mest uppseendeväckande att de fått reda
av var att pspC gen, homolog med den gen hos E.
coli är en del av phage shock protein operon,
hade betydelse för Y. enterocolitica's virulens.
Detta mutant uppvisade mycket låg virulensgrad i
försöksdjur, men växte väl in vitro. Denna gen har
i E. coli någon känd funktion, men vi ser en ökad
uttryck av överuttryck av sekretinproteiner,
bland annat används vid typ III sekretion. Så
en misstänkt koppling till viktiga virulensgener.
Det måste undersökas ytterligare i denna
sammanhang för att förstå vikten av pspC
gen och dess virulensfunktion.
Artikeln har den meningen att den visar att en lång
Antalet virulensgener identifieras ganska
snabbt och relativt enkelt STM metod.
Detta innebär att andra sjukdomsframkallande bakterier, grampositiva
samt Gram-negativa, snabbt
skärmad virulensgener, som kan få betydande
viktigt för sjukdom behandling, läkemedelsutveckling
och vår allmänna kunskap om
patogena bakterier.
Det är också bra i samband med detta
fler och fler organismer (särskilt bakterier) genomet
sekvenser, och behovet av att förstå
betydelsen av enskilda gener i de studerade
organism.
Allmänna verk artikeln vellavet över
försök byggnad, reproducerbarhet och
allmänna strukturen i artikeln.
Särskilda frågor
Fråga 1:
Signaturer Taggade mutagenes (STM) är en teknik
används för att undersöka gener fungerar i
vivo. Du gör en transposon med ett rykte
underskrift sekvens, som sedan överförs till
organism som skall studeras främst av E. coli.
Transposoner, med underskrift tag, sitter en
slumpmässig plats i arvsmassan eller en plasmid, och kommer
således mycket sannolikt störa och
förstöra gen och därmed de översatta
protein. I STM, varje transposon sina egna
unik signatur och kan därefter
hittats av DNA probehybridicering (Södra
bara). Till skillnad från vanliga slumpmässiga transposon
Mutagenes (RTM) där varje
mutation behöver en testdyr till den negativa kontrollen
Här kan du använda en hela potten (om artikeln
använder 96 procent. testdyr) och hitta en specifik
försvagade mutant. I den ursprungliga utformningen av STM som
ritades av Hensel en al.1 används, som i
experiment här hybridiseringsprober, nu en
En annan metod för PCR-detektion, som utvecklats av
Lehoux en al.2 används. Här är tanken att varje
tak förstärks med tag-specifika primers.
Närvaron av en PCR-produkt från en tagg i
ingång pool och avsaknaden av samma PCR-produkten från
produktionen pool visar förlusten av specifika mutant
under negativ selektion screening.
Fördelarna med STM med både signatur-tagg
detekteringsmetoderna är så tydliga, eftersom det både
sparar tid (och därmed pengar) och testdyr. Långtidsspel
nackdelar i förhållande till RTM, jag har svårt att
hitta.
Fråga 2:
Artikeln dobbeltscreener författarna
mutanter. Detta görs genom att sonder är
som syftar till att hybridiseras till det infogade transposon
(Base ihopkoppling principen). När en förvärvar bakterier
från mus mjälte, är de bakterier slutsats att,
vara de som kan infektera musen, så
de bakterier vi inte vill undersöka. Men om
hittade bakterier där, så att säga, saknas
Du kan hitta den gen störs av
Titta på ingång poolen. Detta gör så att
främst försvagade bakterier de injicerar, och
Efter denna dubbla screening erhåller en
resultat som anger att 55 av de ursprungliga 68
mutanter var effektivt försvagade, vilket motsvarar
81%. Detta är en förbättring jämfört med tidigare
resultat, med endast 45% av oskärmad
mutanter var faktiskt försvagade (här skärmad mån
Vibrio kolera).
1 Hensel M, Shea JE, Gleeson C, Jones MD, Dalton E, Holden DW:
Samtidig identifiering av bakteriella virulens gener av negativa
urval. Science 1995, 269:400-403.
2 Lehoux DE, Sanschagrin F, Levesque RC: Definieras olignukleotiden tagg
pooler och PCR screening i signaturetagged Mutagenicitet av essentialism
gener från bakterier. Biotechniques 1999, 26:473-478, 480.
Fråga 3:
Rättegången kommer att avgöra om fenotypiska
förändringar som orsakas av transposon mutagenes eller
om det finns en spontan mutation. På alla
nära en enda mutant kan de utesluta
spontan mutation. Undantaget är homosexuell galleri till
E. coli gen pspC. Därför författarna konstruera
tre nya pspC mutanter i samma stam av Y.
enterocolitica. En ny mutant skulle vara en
kopia av den muterade från den ursprungliga rättegången
medan de andra två skulle vara mutanter med en
infogande-strykning i genen, med en kanamycinresistens
kassett. Kopian gjordes av
införas fragment från originalet förökade
med PCR och jämlikhet i en vektor och överförs till Y.
enterocolitica av konjugering. De andra två var
som kanamycin motstånd kassett var
in i två olika inriktningar av ringen. Av
Dessa tre nya bakterier åter genomfört en
konkurrenceassay. Resultaten av denna analys
med de rekonstruerade mutanter i tabell 3 i
artikel och kan ses i jämförelse med pspC
Resultaten från den första konkurrenceassay (tabell
2) Resultaten är mycket lika - mutanter
infektera möss dåligt, men växer bra i
Vitro. De finner därför att mutationer i pspC
gay galleri Y. enterocolitica det svårare
dess virulens.
Fråga 4:
Typ III sekretion (TTSS) är en komplex
trans-membran proteinstruktur finns i många
Gram-negativa bakterier, patogener och nonpatogene.
I patogena använde det främst
utsöndrar proteiner som hjälper bakterier till
infektera sin värd, och därför finns det starka
förhållandet mellan virulens och förekomsten
av TTSS. Hall Marketplace i systemet är nålen.
Den sitter förankrat endast i den inre membran i
den inre membran ringen, via en kontakt över
peptidoglykanlaget till den yttre membranet ringen
sedan den har passerat hela bakterier
väggsystem. Den faktiska nål hål med en diameter
runt. 3 nm, vilket innebär att merparten effektor
proteiner som ska utsöndras i ovikt skick. (Se fig.
1 nedan)
Figur 1 Schematisk bild av TTSS. Från Wikimedia Commons
Tidigare trodde man att nålen kunde
perforera värdceller, men denna bild är
nu ändrats. Nu teorin att den avger
proteiner som kallas translocators, som utgör en por
i den mottagande cellens membran genom vilka andra
effectors kan flöda.
Artikeln kommer transposoner i en av de mutanter
infogas i ett sycT-yopM gen regionen, och detta
antar att de kan tillgjordhet inblandade gener
i TTSS. De prövar om det beror på fel i
utsöndring av proteiner som kallas yop (Yersinia
yttre proteiner), som hjälper till att perforera
värdceller som är orsaken till det försvagade
virulens. Därför undersökte sammansättningen av protein
i odlingsmedium för de nämnda
mutanter, och jämfört med vildtyp (Fig. 2).
I experiment fann de inga synliga skillnader i
protein bild för mutanter och vild typ.
Fråga 5:
Det finns många bakterier använder TTSS i
deras virulens. Av dessa arter kan
omfatta Shigella (bakteriell dysenteri), Salmonella
(Tyfoidfeber), Escherichia coli (matförgiftning)
Burkholderia (rots), Yersinia (pest), Chlamydophila
(Klamydia) och Pseudomonas. Den stora förekomsten
av TTSS av patogener kan bero på TTSS
kassett kan överföras horisontellt mellan arter.
Som ett exempel kommer jag att använda bakterien Shigella.
Den vanligaste orsaken till shigellainfektion är
kontaminering av livsmedel med avföring. När du har
äta smittade livsmedel eller vatten kommer bakterie
invadera sin värd genom epitelceller i kolon
genom sin TTSS. Detta sprutar det IPAD
protein i epitelceller, som stimulerar den till
införliva bakterien. Detta vakuole bryta ner
den delade IPAB och IPAC proteiner. Här kan
nu dela, och dessutom kan den genom
ICSA protein "ta över" epitelceller aktin
polymeriseringsapparat som den använder för
skjutas runt cellen, och i andra
angränsande celler, som sedan blir infekterade. Totalt orsakar
Shigella ca. 165 miljoner årliga fall av
dysenteri, och ca. En miljon dödsfall - nästan
uteslutande i utvecklingsländer
